はじめに
分析法バリデーションの核心の一つとも言えるのがLOD／LOQ（感度限界）の明確化と、日々の分析条件変動に対する頑健性（Robustness）評価である。
本稿では、LOD／LOQの定義から具体的な算出手法、さらには頑健性解析の計画・実行方法までを取り上げたい。
LOD／LOQの定義と目的
LOD（Limit of Detection；検出限界）とは、シグナルがノイズレベルを上回り、定性的に存在を確認できる最低濃度を指す。
LOQ（Limit of Quantitation；定量限界）とは、定量精度・再現性を満たした上で定量できる最低濃度を指す。
LOD／LOQを設定する目的は、トレースレベルの不純物や痕跡分析の信頼性を担保し、規制要件（ICH Q2(R1)など）に適合させるためである。
LOD／LOQの具体的算出手法
S/N 比法（Signal-to-Noise Ratio）
- 概要
- シグナルピーク高／ノイズの標準偏差を測定
- 計算式
- LOD = 濃度でのS/N ≧ 3
- LOQ = 濃度でのS/N ≧ 10
- 手順
- ブランク溶媒注入でノイズ測定（標準偏差 σn）
- ごく低濃度標準品注入でピーク高 σs を測定
- 必要濃度を希釈系列で探り、S/N比を算出
校正曲線法（標準偏差／傾き法）
- 概要
- 校正直線の傾き（S）と応答の残差（σ）による統計的手法
- 計算式
- LOD = 3.3 × (σ/S)
- LOQ = 10 × (σ/S)
- σの算出方法
- 校正曲線の応答偏差の標準偏差
- またはゼロ濃度のブランク測定値から
校正曲線外挿法（空白＋多倍のσ）
- 概要
- ゼロ標準のピーク高さ平均（μblank）と標準偏差（σblank）から設定
- 計算式
- LOD = μblank + 3σblank
- LOQ = μblank + 10σblank
LOD／LOQの算出手法の比較
| 手法 | メリット | デメリット |
|---|---|---|
| S/N 比法 | 実測ベースで直感的 | ノイズ定義が装置依存 |
| 校正曲線法 | 統計的信頼性が高い | 校正直線の精度に左右される |
| 外挿法 | ブランクだけで評価可 | ブランクピークのバラつきが影響大 |
LC-UV分析のLOD／LOQ設定（実践例）
- 低濃度標準品（0.01–0.1 µg/mL）を連続注入
- ブランク注入でノイズσ = 2.5 µAU
- S/N≧3を満たすピークが0.03 µg/mL → LOD
- S/N≧10を満たすピークが0.10 µg/mL → LOQ
- 校正曲線法でも傾きS = 500 µAU/(µg/mL)、σcalib = 5 µAU
- LOD = 3.3×(5/500) = 0.033 µg/mL
- LOQ = 10×(5/500) = 0.10 µg/mL
頑健性解析の目的と範囲
- 目的：平時の微小な分析条件変動（温度・流速・pHなど）が結果に及ぼす影響を評価
- 対象パラメータ例
- カラム温度：±5 °C
- 流速：±10％
- 移動相pH：±0.2 pH単位
- 検出波長：±2 nm
頑健性解析の計画と実行
実験デザイン（DOE）の活用
- 最小実験計画法（Plackett–Burman設計など）を用い、少ない実験で因子効果を把握
- 因子数が多い場合は直交配列表（Taguchi法）で主要因子を絞り込む
実験ステップ
- 頑健性評価の因子選定（下表参照）
- レベル設定：中心条件±幅
- 測定応答：保持時間、ピーク面積、分離度（Rs）
- データ解析：主効果プロット、交互作用検定
- 受入基準：
- 保持時間変動：±2％以内
- 面積変動：RSD≤2％
- 分離度Rs：>1.5を維持
頑健性評価の因子例
| 因子 | 中心値 | 変動幅 |
|---|---|---|
| カラム温度 | 30 °C | ±5 °C |
| 流速 | 1.0 mL/min | ±0.1 mL/min |
| 移動相pH | 3.0 | ±0.2 |
| 検出波長 | 254 nm | ±2 nm |
データ解析と報告
- 主効果プロットで因子ごと影響度を可視化
- ANOVAで有意差検定
- 結果をバリデーションレポートにまとめ、許容範囲を明記
あとがき
LOD／LOQの適切な設定は分析感度の根幹であり、頑健性解析によって日常分析の信頼性を保証できる。S/N比法や校正曲線法で感度限界を統計的に定義し、DOE手法を活用した頑健性評価を行うことで、どんな変動にも揺るがない分析法を確立したいものである。
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